Question

【題目】為增加油菜種子的含油量，研究人員嘗試將酶D基因與位于葉綠體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因相連，導(dǎo)入油菜細(xì)胞并獲得了轉(zhuǎn)基因油菜品種。

（1）研究人員依據(jù)基因的已知序列設(shè)計引物，采用__________技術(shù)從陸地棉基因文庫中獲取酶D基因，從擬南芥基因文庫中獲取轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因。在上述引物設(shè)計時，分別在引物中加入上圖所示酶的識別序列，這樣可以用____________________酶處理兩個基因后，得到____________端（填圖中字母）相連的融合基因。

（2）將上述融合基因插入右圖所示Ti質(zhì)粒的T－DNA中，構(gòu)建_______________并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。將獲得的農(nóng)桿菌接種在含______________的固體平板上培養(yǎng)得到單菌落，再利用液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，可以得到用于轉(zhuǎn)化的浸染液。

（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是_________________________，進(jìn)一步篩選后培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因油菜。

（4）提取上述轉(zhuǎn)基因油菜的mRNA，在____________酶的作用下獲得cDNA，再依據(jù)融合基因的DNA片段設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測，可判斷融合基因是否________。

Answer 1

【答案】PCR ClaⅠ（限制酶）和DNA連接 A、D 表達(dá)載體（或“重組質(zhì)粒”） 四環(huán)素 利用農(nóng)桿菌將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞 逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄

【解析】

1、基因文庫包括cDNA文庫、基因組文庫等。某個群體包含一種生物所有的基因的文庫叫基因組文庫，而用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA片段屬于cDNA文庫。

2、限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。同種限制酶切割能夠產(chǎn)生相同的黏性末端，便于質(zhì)粒和目的基因連接。

（1）擴(kuò)增目的基因常用PCR技術(shù)。切割獲得酶D基因和轉(zhuǎn)基因肽基因時，應(yīng)該用同種限制酶，以獲得相應(yīng)的黏性末端。因此，可用ClaⅠ限制酶和DNA連接酶處理兩個基因后，得到A、D端相連的融合基因。
（2）將上述融合基因插入右圖所示Ti質(zhì)粒的T-DNA中，構(gòu)建基因表達(dá)載體即重組質(zhì)粒并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。由于質(zhì)粒上含有四環(huán)素抗性基因作為標(biāo)記基因，所以將獲得的農(nóng)桿菌接種在含四環(huán)素的固體平板上培養(yǎng)得到單菌落。

（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是利用農(nóng)桿菌將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞。
（4）提取上述轉(zhuǎn)基因油菜的mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA，再依據(jù)融合基因的DNA片段設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測，可判斷融合基因是否完成轉(zhuǎn)錄。