Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題

（一）研究小組從土壤中分離胞外脲酶高產菌株的過程如下：

（1）尿素固體培養(yǎng)基的配制：將葡萄糖、NaCI、K2HPO4、酚紅、水和凝固劑___________按配方配置好_________，加入三角瓶并用封口膜封口后用__________法滅菌。待冷卻至60℃時，加入經____處理的尿素溶液，搖動，混勻后倒平板。

（2）從___________環(huán)境中采集土樣，用無菌水等梯度稀釋，接種到平板。培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h后，用接種環(huán)挑選___________的菌落，接種到液體培養(yǎng)基中，并震蕩培養(yǎng)48h。

（3）將培養(yǎng)液離心，取___________測定脲酶活性。得到的脲酶可用圖___________法固定化以利于連續(xù)使用。

（二）擬利用轉基因技術將北極海魚的抗凍基因轉入番茄，以提高番茄的抗凍能力，請回答：

（1）將含抗凍基因的DNA和農桿菌的___________用相應的限制性核酸內切酶切割，形成___________，再用DNA連接酶連接獲得重組質粒。

（2）將重組質粒與經___________處理的農桿菌在離心管中混合，在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于___________中慢速培養(yǎng)一段時間，使農桿菌恢復正常狀態(tài)。選用的農桿菌應是限制性核酸內切酶缺陷型菌株，原因是_________________________________。

（3）用農桿菌轉化法獲得含抗凍基因的番茄細胞后，經脫分化形成愈傷組織，再通過調節(jié)培養(yǎng)基中的___________誘導再生出新植株。

（4）請簡要描述個體水平檢測轉基因番茄是否成功表達的實驗思路：______________________。

Answer 1

【答案】瓊脂糖 調節(jié)pH 高壓蒸汽滅菌 G6玻璃砂漏斗/過濾滅菌 有哺乳動物排泄物的 紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑的比值較大 上清液 交聯法 Ti質粒 相同粘性末端 CaCl2 搖床 防止限制性核酸內切酶將目的基因剪切 營養(yǎng)物質和植物生長調節(jié)劑（植物激素）配比 將轉基因番茄和正常番茄置于低溫環(huán)境下，比較轉基因番茄是否具有抗凍性狀

【解析】

（一）細菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細菌，若指示劑變紅，可確定該種細菌能夠產生脲酶，并分解尿素。

（二）基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）瓊脂糖可作為固體培養(yǎng)基中的凝固劑。對培養(yǎng)基應先調節(jié)pH，后高壓蒸汽滅菌法滅菌。待冷卻至60℃時，加入經G6玻璃砂漏斗/過濾滅菌處理的尿素溶液，搖動，混勻后倒平板。

（2）脲酶將尿素分解成氨，哺乳動物排泄物中含有尿素，因此從土壤中分離胞外脲酶高產菌株時，應從有哺乳動物排泄物的環(huán)境中采集土樣，用無菌水等梯度稀釋，接種到平板。脲酶將尿素分解成氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，加入酚紅指示劑，指示劑會變紅。因此用接種環(huán)挑選紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑的比值較大的菌落。

（3）脲酶是細胞分泌物，離心后在上清液中。因此將培養(yǎng)液離心，取上清液測定脲酶活性。圖示為交聯法固定酶。

（二）（1）農桿菌轉化法的原理：農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據農桿菌的這一特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上。構建基因表達載體時，首先將含抗凍基因的DNA和農桿菌的Ti質粒用相應的限制性核酸內切酶切割，形成相同黏性末端，再用DNA連接酶連接獲得重組質粒。
（2）將目的基因導入微生物細胞常采用感受態(tài)細胞法，將重組質粒與經CaCl2處理的農桿菌在離心管中混合，在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床中慢速培養(yǎng)一段時間，使農桿菌恢復正常狀態(tài)。選用的農桿菌應是限制性核酸內切酶缺陷型菌株，防止限制性核酸內切酶將目的基因剪切。
（3）用農桿菌轉化法獲得含抗凍基因的番茄細胞后，經脫分化形成愈傷組織，再通過調節(jié)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質和植物生長調節(jié)劑（植物激素）配比誘導再生出新植株。
（4）從個體水平檢測轉基因番茄是否成功表達的實驗思路：將轉基因番茄和正常番茄置于低溫環(huán)境下，比較轉基因番茄是否具有抗凍性狀。